L-карнитин-индуцированные изменения в профиле экспрессии ключевых генов у цыплят-бройлеров кросса «Смена 9» с учетом половых различий
L-карнитин-индуцированные изменения в профиле экспрессии ключевых генов у цыплят-бройлеров кросса «Смена 9» с учетом половых различий
В условиях современных вызовов, связанных с необходимостью обеспечения продовольственной безопасности и импортозамещения, особое значение приобретают развитие отечественного птицеводства и создание конкурентоспособных кроссов цыплят-бройлеров. Кросс цыплят-бройлеров «Смена 9» — это перспективная разработка российских селекционеров, демонстрирующая хорошие показатели продуктивности и адаптивности к местным условиям выращивания, что делает его привлекательной альтернативой импортным аналогам.
Одним из перспективных направлений повышения эффективности выращивания скота и птицы является оптимизация рациона питания с включением биологически активных веществ, например L-карнитина. L-карнитин, играющий ключевую роль в транспорте жирных кислот в митохондрии для бета-окисления, широко используется в рационах цыплят-бройлеров с целью улучшения роста, повышения качества мяса и снижения жировых отложений. Исследования подтверждают положительное влияние L-карнитина на различные аспекты метаболизма цыплят-бройлеров, включая липидный обмен, энергетический баланс и антиоксидантную защиту.
Однако, несмотря на обширные данные о физиологических эффектах L-карнитина, молекулярные механизмы его действия, особенно в контексте генетической регуляции, изучены недостаточно полно. На зарубежных кроссах цыплят-бройлеров отмечали влияние данного биологически активного вещества на транскрипционный профили. Так, V. Mohammadi и соавт. изучали влияние добавления L-карнитина в рацион петухов кросса Ross 308 на экспрессию отдельных генов, связанных с апоптозом, а также на уровни мРНК десатураз и элонгаз в яичках петухов.
Исследователи обнаружили, что добавление L-карнитина увеличивает экспрессию генов Elovl5 и Fads2, которые участвуют в метаболизме длинноцепочечных жирных кислот. Тем не менее генетический потенциал и физиологические особенности кросса «Смена 9» могут обусловливать специфические ответы на включение L-карнитина в рацион. Вполне возможно, что эффекты L-карнитина могут зависеть от кросса, возраста птицы, дозы и других факторов.
Известно, что состав рациона оказывает значительное влияние на экспрессию генов у цыплят-бройлеров, регулируя процессы роста, развития и метаболизма. Влияние биологически активных добавок на транскрипционный профиль генов открывает новые возможности для оптимизации продуктивности и улучшения качества продукции птицеводства. В связи с этим изучение влияния L-карнитина на экспрессию ключевых генов у цыплят-бройлеров представляет собой актуальную и перспективную задачу. Кроме того, учитывая известный половой диморфизм в росте и метаболизме цыплят-бройлеров, необходимо учитывать возможные различия в экспрессии генов у петушков и курочек при воздействии L-карнитина.
Предварительные исследования, проведенные авторами на курах и петухах исходных линий кросса «Смена 9», показали, что использование комбикормов с пониженной (на 5%) питательностью по лизину, метионину и обменной энергии с применением сульфата лизина и гидроксианалога метионина позволяет поддерживать продуктивность родительского стада на уровне рационов рекомендуемой питательности. В настоящее время комплексные исследования влияния L-карнитина на зоотехнические, физиологические и биохимические показатели, а также на экспрессию генов у цыплят-бройлеров кросса «Смена 9» при раздельном выращивании по полу и использовании комбикормов с пониженной питательностью по лизину, метионину и обменной энергии отсутствуют. Исследования в этом направлении позволят глубже понять молекулярные механизмы действия L-карнитина, оптимизировать стратегию его применения в рационах цыплят-бройлеров и повысить эффективность производства мяса птицы в условиях импортозамещения.
Цели данного исследования — изучение влияния L-карнитина в различных дозировках на экспрессию ключевых генов, регулирующих антиоксидантную защиту (SOD1), иммунный ответ (AvBD1, AvBD2, AvBD9, AvBD10), воспаление и апоптоз (IL6, IL8L2, PTGS2, Casp6), мясную продуктивность (SGLT2) и барьерную функцию эпителия желудочно-кишечного тракта (MUC2) у цыплят-бройлеров кросса «Смена 9» при использовании рационов с пониженной (на 5%) питательностью по лизину, метионину и обменной энергии, а также выявление возможных половых различий в характере этих изменений.
Материалы и методы исследования
В 2024 году на базе Селекционно-генетического центра «Загорское ЭПХ» (Московская обл., Россия) были проведены два эксперимента с цыплятами-бройлерами кросса «Смена 9».
Эксперименты выполняли раздельно для петушков (опыт 1-й) и курочек (опыт 2-й) с 1-го по 35-й день жизни. Птицу содержали в клеточных батареях - по 36 голов в каждой экспериментальной группе. Формирование групп осуществляли по принципу аналогов с учетом возраста, живой массы и клинического состояния птицы.
Условия содержания птицы (плотность посадки, световой режим, температурный режим, влажность, фронт кормления и поения) соответствовали зоотехническим нормативам для кросса «Смена 9» и были идентичными для всех экспериментальных групп.
Кормление осуществляли полнорационными рассыпными комбикормами с дефицитом лизина (в форме сульфата) на 5%, метионина (в форме жидкого гидроксианалога) на 5% и обменной энергии на 5% от рекомендуемых значений для данного кросса. Рационы были унифицированы для петушков и курочек. Применяли схему кормления по периодам: с 1-го по 14-й день — комбикорм «Старт»; с 15-го по 21-й день — комбикорм «Рост»; с 22-го по 35-й день — комбикорм «Финиш».
Уровни добавки в комбикорма всех биологически активных веществ обеспечивали за счет использования витаминно-минерального премикса, рекомендованного для кросса.
Эксперимент проводили с соблюдением принципов, изложенных в Европейской конвенции по охране позвоночных животных, применяемых в экспериментальных и других научных целях (ETS № 123, Страсбург, 1986).
Условия содержания птиц соответствовали зоотехническим требованиям, предъявляемым к выращиванию цыплят-бройлеров.
Плотность посадки, параметры освещения, температурный и влажностный режим, а также доступность корма и воды обеспечивались согласно рекомендациям, разработанным для кросса «Смена 9», на протяжении всего периода выращивания.
В ходе эксперимента осуществляли контроль за сохранностью поголовья и динамикой живой массы цыплят-бройлеров. Индивидуальное взвешивание всех птиц в каждой группе проводили регулярно.
По завершении эксперимента проводили эвтаназию птиц методом декапитации с последующим отбором образцов тканей слепой кишки для анализа экспрессии генов.
Оценку уровня мРНК проводили с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Выделение тотальной РНК из тканей осуществляли с применением набора Aurum™ Total RNA Mini Kit (Bio-Rad, Hercules, США) в соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию РНК и синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили с использованием набора iScript™ Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad, Hercules, США).
В качестве эндогенного контроля экспрессии использовали праймеры к гену ACTB, кодирующему белок бета-актин. Единица измерения экспрессии ключевых генов — количество молекул РНК (например, мРНК) в образце. Результаты были получены с использованием количественной ПЦР (qPCR).
Данные об уровнях экспрессии генов были нормализованы относительно контрольных генов и представлены в виде относительных уровней экспрессии относительно контрольной группы. Результаты представлены в относительных единицах (у. е.), отражающих кратность отклонения от уровня экспрессии соответствующего гена в контрольной группе. Снижение экспрессии гена в опытной группе по сравнению с контролем обозначалось отрицательными значениями, увеличение — положительными.
Амплификацию проводили на детектирующем амплификаторе ДТлайт («ДНК-Технология», Россия) с использованием реакционной смеси SsoAdvanced ™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, США). Программа амплификации включала: начальную денатурацию при 95 °C в течение 5 мин.; 40 циклов, состоящих из денатурации при 95 °C (30 сек.), отжига при 60 °C (30 сек.) и элонгации при 70 °C (30 сек.).
Для математической и статистической обработки полученных данных применяли многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) в Microsoft Excel XP/2003 и среде R-Studio v. 1.1.453 (https://rstudio.com, США). Сравнение средних значений проводили с помощью критерия Тьюки (Honestly Significant Difference, HSD), реализованного функцией TukeyHSD в пакете R Stats Package (США).
Результаты и обсуждение
На рисунке 1 отражена динамика прироста живой массы петушков и курочек кросса «Смена 9» в зависимости от дозировки L-карнитина в комбикорме.
Введение 60–90 г/т корма L-карнитина в рацион положительно сказалось на продуктивности птицы. Так, к 35-суточному возрасту петушки, получавшие L-карнитин в составе комбикорма (III и IV опытные группы), демонстрировали статистически значимо (р ≤ 0,05) больший прирост живой массы (115 г и 119 г соответственно) по сравнению с I (контрольной) группой. Аналогичная тенденция наблюдалась и у курочек: в III и IV опытных группах прирост живой массы составил 104 г и 109 г соответственно, что также статистически значимо (р ≤ 0,05) отличалось от контрольных показателей.
Ранее Rabie M.H. и соавт. обнаружили, что добавление в рацион цыплят-бройлеров L-карнитина в количестве от 20 до 60 мг/кг улучшило показатели роста, тогда как Murali P. и соавт. показано, что добавление L-карнитина в рацион цыплят-бройлеров не повлияло на показатели роста, усвоение питательных веществ и азотный баланс у цыплят-бройлеров.
На рисунке 2 продемонстрировано влияние различных дозировок L-карнитина в составе комбикорма на экспрессию ключевых генов у петушков кросса «Смена 9».
Аналогичные данные для курочек представлены на рисунке 3.
Стоит отметить, что слепые отростки у птиц играют важную роль в пищеварении и иммунной системе, представляя собой место активной ферментации и взаимодействия с микробиотой.
Отмечено повышение экспрессии генов антимикробных пептидов, таких как AvBD9 и AvBD10, особенно в группах с более высокой дозировкой L-карнитина, что указывает на усиление врожденного иммунитета в слепых отростках. Так, в III группе (60 г/т L-карнитина) экспрессия AvBD9 была повышена в 54,4 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с I (контрольной), а в IV группе (90 г/т L-карнитина) экспрессия AvBD10 увеличилась в 10,3 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с I (контрольной).
Белки AvBD (авиан бета-дефензины) являются важными компонентами иммунной защиты слизистой оболочки кишечника, обладая широким спектром антимикробной активности против бактерий, вирусов и грибов, поэтому увеличение их экспрессии может способствовать поддержанию здорового баланса микробиоты, снижению риска инфекций и улучшению усвоения питательных веществ. С учетом того что слепые отростки являются местом активной ферментации клетчатки, усиление иммунной защиты в этой области может быть особенно важным для поддержания здоровья кишечника. С другой стороны, ингибирование мРНК гена IL6 (интерлейкина-6) в III и IV группах в 2,6 и 3,4 раза (р ≤ 0,05) может свидетельствовать о смягчении воспалительных процессов, вызванных, например, дисбактериозом или другими негативными факторами.
Интерлейкин-6 является плейотропным цитокином, который может как стимулировать нормальный иммунный ответ, так и участвовать в развитии хронического воспаления. Ранее было показано, что вызванная L-карнитином активация гена CPT1 предотвращала воспаление за счет снижения воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, в сыворотке и печени. Более высокий уровень мРНК IL6 в настоящем исследовании во II группе (в 9,4 раза выше по сравнению с контролем, р ≤ 0,05), возможно, связан с дозозависимым эффектом L-карнитина.
Изменения в экспрессии гена SOD1, кодирующего супероксиддисмутазу, также заслуживают внимания. Белок SOD1 является ключевым антиоксидантным ферментом, защищающим клетки от повреждения свободными радикалами. Во II группе (30 г/т L-карнитина) экспрессия SOD1 была усилена в 2,3 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с контрольной группой, в III группе (60 г/т L-карнитина) — в 1,4 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с контрольной группой, а в IV группе — неизменна. Эта тенденция указывает на то, что эффект L-карнитина на экспрессию SOD1, по-видимому, наиболее выражен при более низкой дозировке (30 г/т) и снижался с увеличением дозировки. Это может свидетельствовать о дозозависимом, но нелинейном эффекте L-карнитина на антиоксидантную систему в слепых отростках. В целом повышение экспрессии SOD1 может указывать на то, что L-карнитин стимулирует антиоксидантную защиту в слепых отростках, снижая окислительный стресс и защищая клетки от повреждений, вызванных воспалением или другими факторами.
Ранее было показано на млекопитающих, что добавление L-карнитина влияет на удаление свободных радикалов и защищает клетки от окислительного стресса за счет повышения активности ферментов каталазы GPX и SOD.
Кроме того, в IV группе на поголовье петушков экспрессия SGLT2 снизилась до 0,09 (р ≤ 0,05) от уровня контроля. Снижение экспрессии гена SGLT2, кодирующего натрий-глюкозный котранспортер 2, может иметь последствия для метаболизма глюкозы в слепых отростках. Белок SGLT2 участвует в реабсорбции глюкозы в почках, но его роль в кишечнике менее изучена. Снижение экспрессии гена SGLT2 может влиять на доступность глюкозы для микробиоты слепых отростков, что в свою очередь может изменять состав и активность микробиоты.
Экспрессия гена Muc2, кодирующего муцин 2, основного компонента слизистой оболочки кишечника, также претерпевала изменения под влиянием L-карнитина. Индукция экспрессии Muc2 в III группе в 3 раза (р ≤ 0,05) может указывать на усиление защитных свойств слизистой оболочки слепых отростков, что может способствовать поддержанию здоровой среды для микробиоты и улучшению усвоения питательных веществ.
В отличие от петушков, где L-карнитин в высоких дозировках значительно повышал экспрессию AvBD9 и AvBD10, у курочек наблюдалась иная картина (рис. 3). Например, во II группе наблюдалось значительное снижение экспрессии AvBD9 (в 7 раз ниже относительно уровня контроля, р ≤ 0,05) и AvBD10 (в 5,7 раза ниже от уровня контроля, р ≤ 0,05). В III и IV группах экспрессия AvBD9 и AvBD10 была сниженной (р ≤ 0,05). Это может свидетельствовать о различном влиянии L-карнитина на иммунный ответ в слепых отростках у петушков и курочек, возможно, механизмы регуляции экспрессии AvBD генов зависят от пола или гормонального статуса птицы.
В III (в 2,3 раза, р ≤ 0,05) и IV (в 1,9 раза, р ≤ 0,05) группах экспрессия IL6 повышалась так же, как и во II группе, в опыте на петушках. Экспрессия IL8L2 повышалась во всех опытных группах курочек по сравнению с контролем, достигая максимальных значений во II группе (в 3,3 раза, р ≤ 0,05), что может свидетельствовать об активации иммунных клеток и привлечении их в слепые отростки. Отмечено ингибирование экспрессии гена-маркера воспаления PTGS2 (COX-2), особенно в III группе (в 8,2 раза ниже по сравнению с контролем, р ≤ 0,05), что демонстрирует возможность противовоспалительного эффекта L-карнитина в слепых отростках.
Экспрессия гена SOD1, кодирующего супероксиддисмутазу, у курочек была снижена во всех опытных группах по сравнению с контрольной с наиболее выраженным снижением во II группе (р ≤ 0,05), что отличается от результатов, полученных на петушках, где экспрессия SOD1 повышалась во II группе. Данный факт может говорить о разном ответе антиоксидантной системы на L-карнитин у петушков и курочек. Экспрессия гена SGLT2, кодирующего натрий-глюкозный котранспортер 2, у курочек была снижена во всех опытных группах, как и у петушков, с наиболее выраженным снижением в IV группе (снижение в 7,1 раза от уровня контроля, р ≤ 0,05).
Связь между изменениями в экспрессии генов и увеличением живой массы у курочек в III и IV группах может быть опосредована различными механизмами. Например, изменения в экспрессии SGLT2, как уже было сказано, могут влиять на состав микробиоты химуса кишечника и эффективность усвоения питательных веществ, что может отражаться на живой массе птицы. Например, снижение экспрессии SGLT2 может привести к изменению доступности глюкозы для микробиоты, что в свою очередь может способствовать росту определенных видов бактерий, способствующих усвоению питательных веществ и увеличению живой массы.
Таким образом, результаты, полученные на курочках, отличаются от результатов, полученных на петушках, что указывает на гендерные различия в ответе на L-карнитин. На взгляд авторов, влияние половых гормонов на экспрессию генов — это одна из наиболее вероятных причин наблюдаемой разницы. Эстрогены у курочек и андрогены у петушков, по всей видимости, оказывают различное воздействие на регуляцию генов, в том числе изученных авторами. Известно, что эстрогены могут влиять на активность иммунных клеток и модуляцию воспалительных процессов, что в свою очередь способно изменять экспрессию AvBD9/10. Андрогены, с другой стороны, могут оказывать иное влияние на иммунную систему, смещая баланс в сторону определенных иммунных реакций. Более того, половые гормоны напрямую или косвенно воздействуют на метаболические процессы, влияя на усвоение питательных веществ и, как следствие, на экспрессию генов, связанных с транспортом глюкозы (SGLT2) и антиоксидантной защитой (SOD1).
Разница в экспрессии генов может являться следствием метаболических различий между курочками и петушками, которые обусловлены разной скоростью роста и потребностью в энергии. Поэтому влияние L-карнитина на метаболизм липидов и углеводов может проявляться по-разному в зависимости от пола. У петушков, например, повышение экспрессии SOD1 может быть связано с более активным метаболизмом и повышенным уровнем оксидативного стресса, в то время как у курочек снижение экспрессии SOD1 может отражать иные механизмы регуляции антиоксидантной защиты.
Наконец, состав микробиоты кишечника, на который могут влиять как половые гормоны, так и диетические факторы (включая L-карнитин), играет важную роль в модуляции экспрессии генов хозяина. Различия в микробиоте кишечника курочек и петушков могут влиять на доступность питательных веществ, продукцию короткоцепочечных жирных кислот и модуляцию иммунной системы.
Выводы
Введение L-карнитина в комбикорм с пониженным уровнем обменной энергии, лизина и метионина положительно влияет на продуктивность петушков и курочек кросса «Смена 9», однако эффект и механизмы воздействия различаются в зависимости от дозировки и пола птицы. Добавление L-карнитина в количестве 60–90 г/т корма увеличивает прирост живой массы у петушков и курочек к 35-суточному возрасту, в отличие от дозировки 30 г/т корма. У петушков L-карнитин, вероятно, усиливает врожденный иммунитет, повышая экспрессию антимикробных пептидов (AvBD9, AvBD10) и антиоксидантную защиту (SOD1), а также снижает воспалительные процессы (ингибирование IL6). Снижение экспрессии SGLT2 может влиять на метаболизм глюкозы и микробиоту, а индукция экспрессии Muc2 усиливает защитные свойства слизистой оболочки кишечника. В отличие от петушков, у курочек наблюдается снижение экспрессии антимикробных пептидов AvBD9 и AvBD10 под воздействием L-карнитина, что указывает на половые различия в регуляции иммунного ответа в слепых отростках.
В целом результаты показывают, что L-карнитин оказывает комплексное воздействие на физиологические процессы в слепых отростках, включая иммунитет, антиоксидантную защиту и метаболизм глюкозы, однако эти эффекты могут отличаться в зависимости от пола птицы и дозировки L-карнитина, подчеркивая необходимость дальнейших исследований для оптимизации дозировок L-карнитина и учета половых различий при разработке рационов для птицы.
На основании полученных данных можно предположить, что включение L-карнитина в комбикорма цыплят-бройлеров, особенно в рационах с пониженным уровнем обменной энергии, лизина и метионина, может способствовать компенсации негативных эффектов, связанных с дефицитом этих питательных веществ. Однако для подтверждения данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение взаимодействия L-карнитина с компонентами рациона и их соотношением.
Об авторах
Полный текст и таблицы по ссылке:
https://agrarnayanauka.ru/l-karnitin-induczirovannye-izmeneniya-v-profile-ekspressii-klyuchevyh-genov-u-czyplyat-brojlerov-krossa-smena-9-s-uchetom-polovyh-razlichij/
Одним из перспективных направлений повышения эффективности выращивания скота и птицы является оптимизация рациона питания с включением биологически активных веществ, например L-карнитина. L-карнитин, играющий ключевую роль в транспорте жирных кислот в митохондрии для бета-окисления, широко используется в рационах цыплят-бройлеров с целью улучшения роста, повышения качества мяса и снижения жировых отложений. Исследования подтверждают положительное влияние L-карнитина на различные аспекты метаболизма цыплят-бройлеров, включая липидный обмен, энергетический баланс и антиоксидантную защиту.
Однако, несмотря на обширные данные о физиологических эффектах L-карнитина, молекулярные механизмы его действия, особенно в контексте генетической регуляции, изучены недостаточно полно. На зарубежных кроссах цыплят-бройлеров отмечали влияние данного биологически активного вещества на транскрипционный профили. Так, V. Mohammadi и соавт. изучали влияние добавления L-карнитина в рацион петухов кросса Ross 308 на экспрессию отдельных генов, связанных с апоптозом, а также на уровни мРНК десатураз и элонгаз в яичках петухов.
Исследователи обнаружили, что добавление L-карнитина увеличивает экспрессию генов Elovl5 и Fads2, которые участвуют в метаболизме длинноцепочечных жирных кислот. Тем не менее генетический потенциал и физиологические особенности кросса «Смена 9» могут обусловливать специфические ответы на включение L-карнитина в рацион. Вполне возможно, что эффекты L-карнитина могут зависеть от кросса, возраста птицы, дозы и других факторов.
Известно, что состав рациона оказывает значительное влияние на экспрессию генов у цыплят-бройлеров, регулируя процессы роста, развития и метаболизма. Влияние биологически активных добавок на транскрипционный профиль генов открывает новые возможности для оптимизации продуктивности и улучшения качества продукции птицеводства. В связи с этим изучение влияния L-карнитина на экспрессию ключевых генов у цыплят-бройлеров представляет собой актуальную и перспективную задачу. Кроме того, учитывая известный половой диморфизм в росте и метаболизме цыплят-бройлеров, необходимо учитывать возможные различия в экспрессии генов у петушков и курочек при воздействии L-карнитина.
Предварительные исследования, проведенные авторами на курах и петухах исходных линий кросса «Смена 9», показали, что использование комбикормов с пониженной (на 5%) питательностью по лизину, метионину и обменной энергии с применением сульфата лизина и гидроксианалога метионина позволяет поддерживать продуктивность родительского стада на уровне рационов рекомендуемой питательности. В настоящее время комплексные исследования влияния L-карнитина на зоотехнические, физиологические и биохимические показатели, а также на экспрессию генов у цыплят-бройлеров кросса «Смена 9» при раздельном выращивании по полу и использовании комбикормов с пониженной питательностью по лизину, метионину и обменной энергии отсутствуют. Исследования в этом направлении позволят глубже понять молекулярные механизмы действия L-карнитина, оптимизировать стратегию его применения в рационах цыплят-бройлеров и повысить эффективность производства мяса птицы в условиях импортозамещения.
Цели данного исследования — изучение влияния L-карнитина в различных дозировках на экспрессию ключевых генов, регулирующих антиоксидантную защиту (SOD1), иммунный ответ (AvBD1, AvBD2, AvBD9, AvBD10), воспаление и апоптоз (IL6, IL8L2, PTGS2, Casp6), мясную продуктивность (SGLT2) и барьерную функцию эпителия желудочно-кишечного тракта (MUC2) у цыплят-бройлеров кросса «Смена 9» при использовании рационов с пониженной (на 5%) питательностью по лизину, метионину и обменной энергии, а также выявление возможных половых различий в характере этих изменений.
Материалы и методы исследования
В 2024 году на базе Селекционно-генетического центра «Загорское ЭПХ» (Московская обл., Россия) были проведены два эксперимента с цыплятами-бройлерами кросса «Смена 9».
Эксперименты выполняли раздельно для петушков (опыт 1-й) и курочек (опыт 2-й) с 1-го по 35-й день жизни. Птицу содержали в клеточных батареях - по 36 голов в каждой экспериментальной группе. Формирование групп осуществляли по принципу аналогов с учетом возраста, живой массы и клинического состояния птицы.
Условия содержания птицы (плотность посадки, световой режим, температурный режим, влажность, фронт кормления и поения) соответствовали зоотехническим нормативам для кросса «Смена 9» и были идентичными для всех экспериментальных групп.
Кормление осуществляли полнорационными рассыпными комбикормами с дефицитом лизина (в форме сульфата) на 5%, метионина (в форме жидкого гидроксианалога) на 5% и обменной энергии на 5% от рекомендуемых значений для данного кросса. Рационы были унифицированы для петушков и курочек. Применяли схему кормления по периодам: с 1-го по 14-й день — комбикорм «Старт»; с 15-го по 21-й день — комбикорм «Рост»; с 22-го по 35-й день — комбикорм «Финиш».
Уровни добавки в комбикорма всех биологически активных веществ обеспечивали за счет использования витаминно-минерального премикса, рекомендованного для кросса.
Эксперимент проводили с соблюдением принципов, изложенных в Европейской конвенции по охране позвоночных животных, применяемых в экспериментальных и других научных целях (ETS № 123, Страсбург, 1986).
Условия содержания птиц соответствовали зоотехническим требованиям, предъявляемым к выращиванию цыплят-бройлеров.
Плотность посадки, параметры освещения, температурный и влажностный режим, а также доступность корма и воды обеспечивались согласно рекомендациям, разработанным для кросса «Смена 9», на протяжении всего периода выращивания.
В ходе эксперимента осуществляли контроль за сохранностью поголовья и динамикой живой массы цыплят-бройлеров. Индивидуальное взвешивание всех птиц в каждой группе проводили регулярно.
По завершении эксперимента проводили эвтаназию птиц методом декапитации с последующим отбором образцов тканей слепой кишки для анализа экспрессии генов.
Оценку уровня мРНК проводили с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Выделение тотальной РНК из тканей осуществляли с применением набора Aurum™ Total RNA Mini Kit (Bio-Rad, Hercules, США) в соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию РНК и синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили с использованием набора iScript™ Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad, Hercules, США).
В качестве эндогенного контроля экспрессии использовали праймеры к гену ACTB, кодирующему белок бета-актин. Единица измерения экспрессии ключевых генов — количество молекул РНК (например, мРНК) в образце. Результаты были получены с использованием количественной ПЦР (qPCR).
Данные об уровнях экспрессии генов были нормализованы относительно контрольных генов и представлены в виде относительных уровней экспрессии относительно контрольной группы. Результаты представлены в относительных единицах (у. е.), отражающих кратность отклонения от уровня экспрессии соответствующего гена в контрольной группе. Снижение экспрессии гена в опытной группе по сравнению с контролем обозначалось отрицательными значениями, увеличение — положительными.
Амплификацию проводили на детектирующем амплификаторе ДТлайт («ДНК-Технология», Россия) с использованием реакционной смеси SsoAdvanced ™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, США). Программа амплификации включала: начальную денатурацию при 95 °C в течение 5 мин.; 40 циклов, состоящих из денатурации при 95 °C (30 сек.), отжига при 60 °C (30 сек.) и элонгации при 70 °C (30 сек.).
Для математической и статистической обработки полученных данных применяли многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) в Microsoft Excel XP/2003 и среде R-Studio v. 1.1.453 (https://rstudio.com, США). Сравнение средних значений проводили с помощью критерия Тьюки (Honestly Significant Difference, HSD), реализованного функцией TukeyHSD в пакете R Stats Package (США).
Результаты и обсуждение
На рисунке 1 отражена динамика прироста живой массы петушков и курочек кросса «Смена 9» в зависимости от дозировки L-карнитина в комбикорме.
Введение 60–90 г/т корма L-карнитина в рацион положительно сказалось на продуктивности птицы. Так, к 35-суточному возрасту петушки, получавшие L-карнитин в составе комбикорма (III и IV опытные группы), демонстрировали статистически значимо (р ≤ 0,05) больший прирост живой массы (115 г и 119 г соответственно) по сравнению с I (контрольной) группой. Аналогичная тенденция наблюдалась и у курочек: в III и IV опытных группах прирост живой массы составил 104 г и 109 г соответственно, что также статистически значимо (р ≤ 0,05) отличалось от контрольных показателей.
Ранее Rabie M.H. и соавт. обнаружили, что добавление в рацион цыплят-бройлеров L-карнитина в количестве от 20 до 60 мг/кг улучшило показатели роста, тогда как Murali P. и соавт. показано, что добавление L-карнитина в рацион цыплят-бройлеров не повлияло на показатели роста, усвоение питательных веществ и азотный баланс у цыплят-бройлеров.
На рисунке 2 продемонстрировано влияние различных дозировок L-карнитина в составе комбикорма на экспрессию ключевых генов у петушков кросса «Смена 9».
Аналогичные данные для курочек представлены на рисунке 3.
Стоит отметить, что слепые отростки у птиц играют важную роль в пищеварении и иммунной системе, представляя собой место активной ферментации и взаимодействия с микробиотой.
Отмечено повышение экспрессии генов антимикробных пептидов, таких как AvBD9 и AvBD10, особенно в группах с более высокой дозировкой L-карнитина, что указывает на усиление врожденного иммунитета в слепых отростках. Так, в III группе (60 г/т L-карнитина) экспрессия AvBD9 была повышена в 54,4 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с I (контрольной), а в IV группе (90 г/т L-карнитина) экспрессия AvBD10 увеличилась в 10,3 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с I (контрольной).
Белки AvBD (авиан бета-дефензины) являются важными компонентами иммунной защиты слизистой оболочки кишечника, обладая широким спектром антимикробной активности против бактерий, вирусов и грибов, поэтому увеличение их экспрессии может способствовать поддержанию здорового баланса микробиоты, снижению риска инфекций и улучшению усвоения питательных веществ. С учетом того что слепые отростки являются местом активной ферментации клетчатки, усиление иммунной защиты в этой области может быть особенно важным для поддержания здоровья кишечника. С другой стороны, ингибирование мРНК гена IL6 (интерлейкина-6) в III и IV группах в 2,6 и 3,4 раза (р ≤ 0,05) может свидетельствовать о смягчении воспалительных процессов, вызванных, например, дисбактериозом или другими негативными факторами.
Интерлейкин-6 является плейотропным цитокином, который может как стимулировать нормальный иммунный ответ, так и участвовать в развитии хронического воспаления. Ранее было показано, что вызванная L-карнитином активация гена CPT1 предотвращала воспаление за счет снижения воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, в сыворотке и печени. Более высокий уровень мРНК IL6 в настоящем исследовании во II группе (в 9,4 раза выше по сравнению с контролем, р ≤ 0,05), возможно, связан с дозозависимым эффектом L-карнитина.
Изменения в экспрессии гена SOD1, кодирующего супероксиддисмутазу, также заслуживают внимания. Белок SOD1 является ключевым антиоксидантным ферментом, защищающим клетки от повреждения свободными радикалами. Во II группе (30 г/т L-карнитина) экспрессия SOD1 была усилена в 2,3 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с контрольной группой, в III группе (60 г/т L-карнитина) — в 1,4 раза (р ≤ 0,05) по сравнению с контрольной группой, а в IV группе — неизменна. Эта тенденция указывает на то, что эффект L-карнитина на экспрессию SOD1, по-видимому, наиболее выражен при более низкой дозировке (30 г/т) и снижался с увеличением дозировки. Это может свидетельствовать о дозозависимом, но нелинейном эффекте L-карнитина на антиоксидантную систему в слепых отростках. В целом повышение экспрессии SOD1 может указывать на то, что L-карнитин стимулирует антиоксидантную защиту в слепых отростках, снижая окислительный стресс и защищая клетки от повреждений, вызванных воспалением или другими факторами.
Ранее было показано на млекопитающих, что добавление L-карнитина влияет на удаление свободных радикалов и защищает клетки от окислительного стресса за счет повышения активности ферментов каталазы GPX и SOD.
Кроме того, в IV группе на поголовье петушков экспрессия SGLT2 снизилась до 0,09 (р ≤ 0,05) от уровня контроля. Снижение экспрессии гена SGLT2, кодирующего натрий-глюкозный котранспортер 2, может иметь последствия для метаболизма глюкозы в слепых отростках. Белок SGLT2 участвует в реабсорбции глюкозы в почках, но его роль в кишечнике менее изучена. Снижение экспрессии гена SGLT2 может влиять на доступность глюкозы для микробиоты слепых отростков, что в свою очередь может изменять состав и активность микробиоты.
Экспрессия гена Muc2, кодирующего муцин 2, основного компонента слизистой оболочки кишечника, также претерпевала изменения под влиянием L-карнитина. Индукция экспрессии Muc2 в III группе в 3 раза (р ≤ 0,05) может указывать на усиление защитных свойств слизистой оболочки слепых отростков, что может способствовать поддержанию здоровой среды для микробиоты и улучшению усвоения питательных веществ.
В отличие от петушков, где L-карнитин в высоких дозировках значительно повышал экспрессию AvBD9 и AvBD10, у курочек наблюдалась иная картина (рис. 3). Например, во II группе наблюдалось значительное снижение экспрессии AvBD9 (в 7 раз ниже относительно уровня контроля, р ≤ 0,05) и AvBD10 (в 5,7 раза ниже от уровня контроля, р ≤ 0,05). В III и IV группах экспрессия AvBD9 и AvBD10 была сниженной (р ≤ 0,05). Это может свидетельствовать о различном влиянии L-карнитина на иммунный ответ в слепых отростках у петушков и курочек, возможно, механизмы регуляции экспрессии AvBD генов зависят от пола или гормонального статуса птицы.
В III (в 2,3 раза, р ≤ 0,05) и IV (в 1,9 раза, р ≤ 0,05) группах экспрессия IL6 повышалась так же, как и во II группе, в опыте на петушках. Экспрессия IL8L2 повышалась во всех опытных группах курочек по сравнению с контролем, достигая максимальных значений во II группе (в 3,3 раза, р ≤ 0,05), что может свидетельствовать об активации иммунных клеток и привлечении их в слепые отростки. Отмечено ингибирование экспрессии гена-маркера воспаления PTGS2 (COX-2), особенно в III группе (в 8,2 раза ниже по сравнению с контролем, р ≤ 0,05), что демонстрирует возможность противовоспалительного эффекта L-карнитина в слепых отростках.
Экспрессия гена SOD1, кодирующего супероксиддисмутазу, у курочек была снижена во всех опытных группах по сравнению с контрольной с наиболее выраженным снижением во II группе (р ≤ 0,05), что отличается от результатов, полученных на петушках, где экспрессия SOD1 повышалась во II группе. Данный факт может говорить о разном ответе антиоксидантной системы на L-карнитин у петушков и курочек. Экспрессия гена SGLT2, кодирующего натрий-глюкозный котранспортер 2, у курочек была снижена во всех опытных группах, как и у петушков, с наиболее выраженным снижением в IV группе (снижение в 7,1 раза от уровня контроля, р ≤ 0,05).
Связь между изменениями в экспрессии генов и увеличением живой массы у курочек в III и IV группах может быть опосредована различными механизмами. Например, изменения в экспрессии SGLT2, как уже было сказано, могут влиять на состав микробиоты химуса кишечника и эффективность усвоения питательных веществ, что может отражаться на живой массе птицы. Например, снижение экспрессии SGLT2 может привести к изменению доступности глюкозы для микробиоты, что в свою очередь может способствовать росту определенных видов бактерий, способствующих усвоению питательных веществ и увеличению живой массы.
Таким образом, результаты, полученные на курочках, отличаются от результатов, полученных на петушках, что указывает на гендерные различия в ответе на L-карнитин. На взгляд авторов, влияние половых гормонов на экспрессию генов — это одна из наиболее вероятных причин наблюдаемой разницы. Эстрогены у курочек и андрогены у петушков, по всей видимости, оказывают различное воздействие на регуляцию генов, в том числе изученных авторами. Известно, что эстрогены могут влиять на активность иммунных клеток и модуляцию воспалительных процессов, что в свою очередь способно изменять экспрессию AvBD9/10. Андрогены, с другой стороны, могут оказывать иное влияние на иммунную систему, смещая баланс в сторону определенных иммунных реакций. Более того, половые гормоны напрямую или косвенно воздействуют на метаболические процессы, влияя на усвоение питательных веществ и, как следствие, на экспрессию генов, связанных с транспортом глюкозы (SGLT2) и антиоксидантной защитой (SOD1).
Разница в экспрессии генов может являться следствием метаболических различий между курочками и петушками, которые обусловлены разной скоростью роста и потребностью в энергии. Поэтому влияние L-карнитина на метаболизм липидов и углеводов может проявляться по-разному в зависимости от пола. У петушков, например, повышение экспрессии SOD1 может быть связано с более активным метаболизмом и повышенным уровнем оксидативного стресса, в то время как у курочек снижение экспрессии SOD1 может отражать иные механизмы регуляции антиоксидантной защиты.
Наконец, состав микробиоты кишечника, на который могут влиять как половые гормоны, так и диетические факторы (включая L-карнитин), играет важную роль в модуляции экспрессии генов хозяина. Различия в микробиоте кишечника курочек и петушков могут влиять на доступность питательных веществ, продукцию короткоцепочечных жирных кислот и модуляцию иммунной системы.
Выводы
Введение L-карнитина в комбикорм с пониженным уровнем обменной энергии, лизина и метионина положительно влияет на продуктивность петушков и курочек кросса «Смена 9», однако эффект и механизмы воздействия различаются в зависимости от дозировки и пола птицы. Добавление L-карнитина в количестве 60–90 г/т корма увеличивает прирост живой массы у петушков и курочек к 35-суточному возрасту, в отличие от дозировки 30 г/т корма. У петушков L-карнитин, вероятно, усиливает врожденный иммунитет, повышая экспрессию антимикробных пептидов (AvBD9, AvBD10) и антиоксидантную защиту (SOD1), а также снижает воспалительные процессы (ингибирование IL6). Снижение экспрессии SGLT2 может влиять на метаболизм глюкозы и микробиоту, а индукция экспрессии Muc2 усиливает защитные свойства слизистой оболочки кишечника. В отличие от петушков, у курочек наблюдается снижение экспрессии антимикробных пептидов AvBD9 и AvBD10 под воздействием L-карнитина, что указывает на половые различия в регуляции иммунного ответа в слепых отростках.
В целом результаты показывают, что L-карнитин оказывает комплексное воздействие на физиологические процессы в слепых отростках, включая иммунитет, антиоксидантную защиту и метаболизм глюкозы, однако эти эффекты могут отличаться в зависимости от пола птицы и дозировки L-карнитина, подчеркивая необходимость дальнейших исследований для оптимизации дозировок L-карнитина и учета половых различий при разработке рационов для птицы.
На основании полученных данных можно предположить, что включение L-карнитина в комбикорма цыплят-бройлеров, особенно в рационах с пониженным уровнем обменной энергии, лизина и метионина, может способствовать компенсации негативных эффектов, связанных с дефицитом этих питательных веществ. Однако для подтверждения данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение взаимодействия L-карнитина с компонентами рациона и их соотношением.
Об авторах
Полный текст и таблицы по ссылке:
https://agrarnayanauka.ru/l-karnitin-induczirovannye-izmeneniya-v-profile-ekspressii-klyuchevyh-genov-u-czyplyat-brojlerov-krossa-smena-9-s-uchetom-polovyh-razlichij/
Источник: https://agrarnayanauka.ru/
