Определение пола и генотипирование методом ПЦР in ovo указывают на 7-й день развития эмбриона.
Определение пола и генотипирование методом ПЦР in ovo указывают на 7-й день развития эмбриона.
В новой статье в Scientific Reports представлена наиболее подробная на сегодняшний день оценка раннего определения пола и генотипирования in ovo с использованием методов на основе ПЦР у кур, предлагающая своевременную информацию для птицеводов, инкубаторов и исследовательских институтов, стремящихся соответствовать ожесточающемся правилам благополучия животных и сократить выбраковку избыточного количества самцов цыплят.
В ходе исследования было протестировано более 800 яиц от кур различных линий – включая коммерческие куры-несушки и генетически модифицированную исследовательскую линию – с использованием простого алгоритма, сочетающего полногеномную амплификацию, конкурентную аллель-специфическую ПЦР (KASP) и стандартную конечную ПЦР. Результаты четко указывают на 7-й эмбриональный день (ЭД7) как на оптимальное время для отбора проб.
Практичный и точный метод для мелкомасштабных и исследовательских условий
Хотя уже существуют промышленные автоматизированные системы определения пола на ЭД8-10, многие лаборатории не имеют доступа к высокопроизводительным платформам. Целью данного исследования было создание доступного метода с использованием стандартного лабораторного оборудования. Исследователи успешно применили свой алгоритм на ЭД4-ЭД10, но обнаружили, что результаты становятся все более надежными по мере продвижения инкубации.
На ранних стадиях (ЭД4-ЭД6) выход ДНК был низким, а качество образцов – непостоянным, что снижало показатели успешности ПЦР до 70-80%. К 7-му дню эмбрионального развития (ED7) как успешность, так и точность значительно улучшились, обеспечив точность идентификации в 92-100% как для определения пола, так и для генотипирования в ходе экспериментов.
Этап амплификации всего генома оказался необходимым, поскольку позволил преодолеть очень низкое содержание ДНК, характерное для ранних эмбриональных жидкостей. Методы KASP и мультиплексной ПЦР эффективно работали на более поздних стадиях, хотя метод KASP иногда требовал повторных запусков из-за неоднозначности кластеров флуоресценции – вероятно, из-за влияния богатой мочевой кислотой аллантоисной жидкости.
Почему ED7 работает лучше всего
Авторы представили четкое биологическое обоснование для ED7 как предпочтительного периода отбора проб. Визуализация культуры без скорлупы показала, что аллантоисный мешок значительно расширяется между ED6 и ED7, предлагая больший и более стабильный резервуар целевой жидкости, одновременно снижая риск прокола амниона.
Ранние образцы (ED4–ED6) часто содержали «желтоватую» субэмбриональную жидкость, которая менее подходит для выделения ДНК, что соответствует стадии развития, когда эмбрион более чувствителен к внешним воздействиям. В отличие от этого, жидкость ED7 была неизменно прозрачной, с более высоким содержанием ДНК и гораздо лучшими показателями ПЦР.
ED7 также учитывает этические соображения: она позволяет точно определить пол до ED13, стадии, на которой, как считается, начинается ноцицепция (восприятие боли).
Вылупляемость: минимальное воздействие при правильном проведении исследования
В исследовании оценивалась вылупляемость тысяч яиц в 3 основных фазах. Результаты были обнадеживающими:
Фаза I (Араукана × Белый Леггорн): в проколотых яйцах вылупилось 84% птенцов против 92% в контрольных; разница достигла статистической значимости, хотя различия в смертности на средней стадии эмбрионального развития не были статистически значимыми.
Фаза II (коммерческие коричневые и белые несушки): показатели выводимости неуклонно улучшались с ED4 по ED7, достигнув 87% (коричневые) и 97% (белые) на ED7. Не было обнаружено доказательств того, что прокол на ED7 негативно повлиял на выводимость.
Фаза III (генетически модифицированная линия iCaspase9): выживаемость эмбрионов составила 92% в проколотых яйцах против 96% в контрольных, без существенной разницы.
Во всех линиях ED7 значительно снизил сложность отбора проб и потери эмбрионов. Ранний отбор проб (особенно ED6) часто требовал повторных попыток прокола – до 25% яиц – что увеличивало риск.
Инструмент для сокращения количества избыточных самцов цыплят
Авторы подчеркивают, что этот метод поддерживает принципы 3R (замена, сокращение, улучшение), позволяя удалять нежелательных самцов или генетически непригодных эмбрионов до вылупления. Это особенно актуально в тех случаях, когда законодательство запрещает выбраковку суточных цыплят, в том числе во Франции и Германии, и когда исследовательские институты должны минимизировать избыток животных.
Для селекционных программ с использованием генетически модифицированных или специализированных исследовательских линий раннее генотипирование также снижает необходимость выращивания бесполезных птиц.
Последствия для промышленности и исследований
Хотя исследование сосредоточено на лабораторных, а не промышленных показателях, полученные результаты дают ценные рекомендации:
ED7 — это оптимальное сочетание точности, благополучия и выводимости.
Метод является недорогим, воспроизводимым и адаптируемым, подходящим для небольших исследовательских лабораторий и нишевых селекционеров.
Раннее генотипирование на основе ПЦР может дополнить или подтвердить результаты emergi
В ходе исследования было протестировано более 800 яиц от кур различных линий – включая коммерческие куры-несушки и генетически модифицированную исследовательскую линию – с использованием простого алгоритма, сочетающего полногеномную амплификацию, конкурентную аллель-специфическую ПЦР (KASP) и стандартную конечную ПЦР. Результаты четко указывают на 7-й эмбриональный день (ЭД7) как на оптимальное время для отбора проб.
Практичный и точный метод для мелкомасштабных и исследовательских условий
Хотя уже существуют промышленные автоматизированные системы определения пола на ЭД8-10, многие лаборатории не имеют доступа к высокопроизводительным платформам. Целью данного исследования было создание доступного метода с использованием стандартного лабораторного оборудования. Исследователи успешно применили свой алгоритм на ЭД4-ЭД10, но обнаружили, что результаты становятся все более надежными по мере продвижения инкубации.
На ранних стадиях (ЭД4-ЭД6) выход ДНК был низким, а качество образцов – непостоянным, что снижало показатели успешности ПЦР до 70-80%. К 7-му дню эмбрионального развития (ED7) как успешность, так и точность значительно улучшились, обеспечив точность идентификации в 92-100% как для определения пола, так и для генотипирования в ходе экспериментов.
Этап амплификации всего генома оказался необходимым, поскольку позволил преодолеть очень низкое содержание ДНК, характерное для ранних эмбриональных жидкостей. Методы KASP и мультиплексной ПЦР эффективно работали на более поздних стадиях, хотя метод KASP иногда требовал повторных запусков из-за неоднозначности кластеров флуоресценции – вероятно, из-за влияния богатой мочевой кислотой аллантоисной жидкости.
Почему ED7 работает лучше всего
Авторы представили четкое биологическое обоснование для ED7 как предпочтительного периода отбора проб. Визуализация культуры без скорлупы показала, что аллантоисный мешок значительно расширяется между ED6 и ED7, предлагая больший и более стабильный резервуар целевой жидкости, одновременно снижая риск прокола амниона.
Ранние образцы (ED4–ED6) часто содержали «желтоватую» субэмбриональную жидкость, которая менее подходит для выделения ДНК, что соответствует стадии развития, когда эмбрион более чувствителен к внешним воздействиям. В отличие от этого, жидкость ED7 была неизменно прозрачной, с более высоким содержанием ДНК и гораздо лучшими показателями ПЦР.
ED7 также учитывает этические соображения: она позволяет точно определить пол до ED13, стадии, на которой, как считается, начинается ноцицепция (восприятие боли).
Вылупляемость: минимальное воздействие при правильном проведении исследования
В исследовании оценивалась вылупляемость тысяч яиц в 3 основных фазах. Результаты были обнадеживающими:
Фаза I (Араукана × Белый Леггорн): в проколотых яйцах вылупилось 84% птенцов против 92% в контрольных; разница достигла статистической значимости, хотя различия в смертности на средней стадии эмбрионального развития не были статистически значимыми.
Фаза II (коммерческие коричневые и белые несушки): показатели выводимости неуклонно улучшались с ED4 по ED7, достигнув 87% (коричневые) и 97% (белые) на ED7. Не было обнаружено доказательств того, что прокол на ED7 негативно повлиял на выводимость.
Фаза III (генетически модифицированная линия iCaspase9): выживаемость эмбрионов составила 92% в проколотых яйцах против 96% в контрольных, без существенной разницы.
Во всех линиях ED7 значительно снизил сложность отбора проб и потери эмбрионов. Ранний отбор проб (особенно ED6) часто требовал повторных попыток прокола – до 25% яиц – что увеличивало риск.
Инструмент для сокращения количества избыточных самцов цыплят
Авторы подчеркивают, что этот метод поддерживает принципы 3R (замена, сокращение, улучшение), позволяя удалять нежелательных самцов или генетически непригодных эмбрионов до вылупления. Это особенно актуально в тех случаях, когда законодательство запрещает выбраковку суточных цыплят, в том числе во Франции и Германии, и когда исследовательские институты должны минимизировать избыток животных.
Для селекционных программ с использованием генетически модифицированных или специализированных исследовательских линий раннее генотипирование также снижает необходимость выращивания бесполезных птиц.
Последствия для промышленности и исследований
Хотя исследование сосредоточено на лабораторных, а не промышленных показателях, полученные результаты дают ценные рекомендации:
ED7 — это оптимальное сочетание точности, благополучия и выводимости.
Метод является недорогим, воспроизводимым и адаптируемым, подходящим для небольших исследовательских лабораторий и нишевых селекционеров.
Раннее генотипирование на основе ПЦР может дополнить или подтвердить результаты emergi
Источник: https://www.poultryworld.net
